连字符的仪器是混合两种不同技术的能力,以形成具有新能力的新分析技术。显微镜分光光度计是一种这样的连字仪;它是一种杂交,将光学显微镜的放大功率与UV可见NIR范围分光光度计的分析型突出相结合。因此,显微镜分光光度计可用于测量从深紫色到近红外区域的微观样品区域的分子光谱。它们可以配置出许多不同类型的光谱学,并且因此用于测量微米尺寸样品的吸光度,反射率和甚至发射光谱,例如荧光和光致发光。随着专用算法的添加,显微镜分光光度计也可用于测量薄膜的厚度或用作显微镜的色度计。

使用显微镜分光光度计有很多原因。最明显的是可以从小于微米的样本区域获取光谱。另外,这些仪器仅需要少量的样品以固体或液体形式。另一个优点是许多样品需要很少或没有准备。通过光谱学的颜色比较往往具有光学光度计更准确,因为这些仪器具有更宽的光谱范围,可以校正照明变化,并且可以测量每个波长光带的强度。

在显微光谱学出现之前,分析许多类型的显微样品的唯一方法是使用微量化学测试,然后是某种视觉检查。不幸的是,这些方法往往是破坏性的,需要大量的样本,并遭受不准确的人类视觉系统。显微镜分光光度计避免了这些问题,可以“看到”超出人眼的范围,并探测到其他情况下不明显的变化。

显微分光光度计的设计

显微镜分光光度计集成了光学或光学显微镜与紫外-可见-近红外范围分光光度计(图1)。显微镜是一种设备,旨在放大小物体的图像,使它们能够被研究。分光光度计是一种仪器,测量从紫外线通过可见光和近红外区域的每个波长的光的强度。通过适当配置的显微镜分光光度计,可以获得亚微米尺度上采样区域的吸光度、反射率和发射光谱。

为了覆盖如此宽的光谱范围,以良好的图像和光谱质量,定制设计的显微镜,并与分光光度计集成。由于光学材料和光源本身的原因,标准光学显微镜的光谱范围有限,只能覆盖可见区域的一部分。现代显微镜分光光度计采用定制的显微镜,具有光学设计和光源优化的深紫外光通过近红外。

分光光度计本身也必须设计用于微谍谱检查以获得良好的光谱结果。这意味着分光光度计必须高度敏感,同时仍保持可接受的光谱分辨率。稳定性也是一个问题,因为显微镜分光光度计是单光束仪器,并且必须在测量样品之前获得参考光谱。仪器还必须具有高动态范围,因为在测量相同的样品时经常从透射或反射微穴位切换到荧光光谱的频率。这允许您从微观样本上的完全相同的位置获得不同类型的光谱信息。

分光光度计与显微镜的集成是至关重要的。虽然显微镜和分光光度计都必须为显微光谱学进行优化,但显微镜分光光度计操作的关键是使它们能够一起工作的硬件。这个接口有几个基本要求。最重要的是,它必须将显微镜从样品中收集到的电磁能量导入分光光度计。然而,用户必须能够可视化的样品测量区域,但也看到周围的样品。这是通过使分光光度计的入口孔径在与样品图像相同的焦平面上完成的。然后样品可以随着显微镜平台移动,就像人们通常用显微镜做的那样,直到入口孔径的图像超过要测量的面积。在图2中,图像中心的黑色方块是分光光度计的入口孔径。所有这些都是实时完成的,因此显微镜样品的光谱学是快速和简单的。

图2.用显微镜分光光度计对样品成像时,图像中心的黑色正方形是分光光度计的入口孔径。用户简单地移动样品级,使得黑色正方形叠加在与该OLED显示器一起测量的区域上。(CRAIC Technologies, Inc.)

如图3所示,显微镜光学元件将光聚焦到样品上。然后通过显微镜物镜从样品中收集电磁能。来自物镜的光聚焦在分光光度计的镜像入口孔上。大部分光从入口光圈表面反射到相机上。分光光度计孔也被相机成像,使其在样品上显示为黑色正方形(图2)。这允许显微镜分光光度计轻松快速地对准。通过入口孔径的光然后通过测量光谱的分光光度计。

图3。显示用于荧光显微光谱学和成像的显微镜分光光度计的光路示意图。(CRAIC Technologies, Inc.)

根据要进行的实验类型,显微镜可以配置不同的照明方案。白光入射照明允许从深紫外光到近红外的反射率微光谱分析。入射照明也可用于荧光或光致发光显微光谱学。此外,通过显微镜冷凝器将白光聚焦到样品上,就可以实现透射显微光谱学。

显微镜的应用

第一显微镜分光光度计在20世纪40年代开发,从那时起,已经开发了许多不同的应用。通过获取显微镜样本区域的光谱的能力,从大学实验室到生产线以获得质量控制和失败分析的显微镜分光光度计。

法医学。自20世纪80年代初以来,法医证据分析一直是显微镜分光光度计最重要的应用之一。最大的努力是在分析痕量证据,特别是纺织纤维和油漆碎片。顾名思义,这类样品通常是显微镜下的,作为证据,不应该在测试中被损坏或破坏。对于纤维,使用显微镜分光光度计来测量单个纤维的紫外-可见-近红外吸收光谱和荧光光谱。通常对油漆切片进行横切,然后测量每一层的吸光度谱,这样已知的和有疑问的样品就可以进行高度的鉴别比较。

平板显示器上。现代平板显示器由数百万个彩色像素组成。随着技术的进步,像素变得越来越小,在越来越大的表面上变得越来越紧密。最现代的显示器使用不同的技术,如量子点和有机光发射二极管,在微观尺度上创造不同颜色的像素。显微镜分光光度计被用来帮助开发这些材料作为可行的光源,并最终作为显示器3,4。显微镜分光光度计也用于生产过程中,以确保颜色和像素的强度在整个显示器上是一致的,从而确保明亮和均匀的照亮图像在整个显示器上。

能量。煤和烃源岩中含有镜质组等显微组分。显微镜分光光度计被用来对煤、焦炭和石油烃源岩的热成熟度进行分级,从而对其能量含量进行分级。这是通过在抛光样品上测量镜质体的绝对反射率来实现的。根据反射率,可以确定样品的热成熟度。

纳米技术。显微镜分光光度计基于其测量透射、反射和发射光谱显微样品区域的能力,也推动了纳米技术和材料科学的发展。一个快速增长的应用领域是表面等离子体共振(SPR)6,7,8的开发和使用。

通过用光照亮平面金属表面或纳米级金属颗粒来激发表面等离子体(图4)。当这些纳米颗粒或表面与其他材料相互作用时,这些材料的光学特性的变化发生。因此,正在进行大量工作以开发出现某种形式的等离子体共振的新材料,而且还可以构建具有这些现象的设备。后者包括各种类型的生物传感器和微流体装置传感器。显微镜分光光度计测量SPR材料的光谱如何在不同的条件下改变,使研究人员能够表征新材料的能力,然后“调谐”材料进行特定光学效应。

图4。开发了纳米金薄膜的紫外-可见-近红外吸收光谱作为水分传感器。红色的痕迹来自薄膜干燥的表面,而蓝色的痕迹来自薄膜湿润的表面。(CRAIC Technologies, Inc.)

结论

显微镜分光光度计是将光学显微镜与分光光度计结合的连字显微镜技术,以便可以获得微观样品区域的光谱。这种仪器能够通过可见光和近红外区域从深紫外线吸光和反射光谱。显微镜分光光度计还可以测量荧光和其他类型的发射光谱。这些设备在许多领域中发现了包括法证科学,半导体和光学膜厚度测量,生物技术和最新材料科学的领域。

参考

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本文由CRAIC Technologies (San Dimas, CA)总裁Paul Martin博士撰写。欲了解更多信息,请联系马丁博士此电子邮件地址正受到垃圾邮件程序的保护。您需要启用JavaScript才能查看它。或者访问这里


Photonics&Imaging Technology杂志

本文首先出现在9月,2021年问题光子学与成像技术杂志。

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